PCR技术系列高级讲座（一）影响PCR成功的关键因素

PCR技术系列高级讲座（一）影响PCR成功的关键因素   

无论您是新手上路, 还是有经验的专家, 花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术部专家编辑的文字, 相信您会从中获得新的信息!

PCR又称聚合酶链反应 (Polymerse Chain Reaction)自八十年代问世以来, 因其在基因研究中的独特作用而受到极大关注, 并已成为当今生命科学研究不可或缺的工具。 由于PCR扩增DNA具有高效性、特异性、敏感性和可重复性等特点, 使得它在分子生物学研究中的应用日益广泛,并由此而衍生出以其为基础的新技术如RT-PCR、 多重PCR、巢式与半巢式PCR、 连结介导的PCR、步移PCR等。PCR应用较多的方面主要是DNA鉴定、克隆和测序。PCR技术本身是非常简单的, 几乎可以说是人人都可以使用, 但要充分利用好PCR及其衍生技术, 从而最大程度为自己的课题研究服务则大有学问。这里只从理论和经验上讨论一般PCR, 对于由PCR衍生的其它技术,可发邮件到：fungenome@126.com

影响PCR成功的关键因素有三个：引物设计、高温聚合酶的选择和扩增条件

1.  引物设计

    用于引物设计的程序有多种,不同的实验室根据其已掌握的资源和习惯会选用不同的软件,而不同的软件对同一引物进行评价的结果可能会有较大的差异。较为常用的有 DNAStar, DNAStrider, Generunner, Oligo6.0, Premier5.0 等。不论采用何种软件, 常规引物的设计(长引物除外)应尽可能遵循以下原则：

1). GC含量一般在40—50%为宜；如果模板为高等生物基因组DNA, 则GC含量应适当提高, 一般在55—65%为宜, 这样可在大部分情况下有效地减少非特异性扩增。

2). 引物的3’端不能有稳定的发夹结构。以热力学能量计算来定义则就是用于打开可能形成的引物法夹结构的能量不宜超过4千卡.

3). 引物的3’端不能形成稳定的自身二聚体和交叉二聚体。以热力学能量计算来定义则就是用于打开可能形成的引物二聚体的能量不宜超过9千卡。.

4). 符合上述标准的引物基本上可采用以下扩增条件：94 0C-2min 热变性后, 进行30-35个下述循环：94 0C -30s, 550C-30s, 720C-extension (1 min/1kb, 如为Pfu则需适当延长时间).。

5). 如果不能满足上述要求, 寻求解决之道的第一选择就是更换引物设计区；如果因特殊需要(例如克隆基因编码区、融合读码框架等)而必须限定在特定序列区域时, 适当改变引物长度往往会有奇效；如经过尝试仍不能解决问题, 可发邮件到泛基诺技术部邮箱寻求帮助：fungenome@126.com 。     

 需要指出的是, 经理论评价符合标准的引物在实际PCR扩增时并不是100%都能成功, 而经理论评价不符合标准的引物并不意味着100%的失败。